开发高效液相色谱（HPLC）分析方法，包括色谱柱化学模式选择、流动相 和梯度设计、流速和柱温优化，以及检测器选择。用于药物杂质分析、 生物分子分析、食品和环境样品的定量检测。
通过系统选择色谱模式和固定相、优化流动相组成和梯度程序、选择检测器，并进行系统适应性验证，开发满足分离要求的 HPLC 分析方法。
根据分析物的理化性质选择分离模式：
分离模式选择导图：
分析物是否可溶于有机溶剂和水？
├─ 是 → 分子量 < 2000 Da？
│ ├─ 是 → 是否含有可解离基团（酸/碱）？
│ │ ├─ 是 → 反相 HPLC（C18/C8）+ pH 控制
│ │ └─ 否 → 反相 HPLC（C18）或正相 HPLC（极性固定相）
│ └─ 否 → 体积排阻色谱（SEC）
├─ 是，水溶性极好 → 亲水相互作用色谱（HILIC）
└─ 不溶于有机溶剂 → 离子交换色谱（IEC）
常见固定相选择参考：
| 固定相 | 化学类型 | 适用范围 |
|---|---|---|
| C18（十八烷基） | 反相，非极性 | 大多数有机小分子（通用首选） |
| C8（辛基） | 反相，中等疏水 | 比 C18 保留弱，适用于强保留化合物 |
| 苯基丙基 | 反相 + π-π 作用 | 含芳香环的化合物，尤其是位置异构体 |
| HILIC（亲水相互作用） | 极性，水富集层 | 亲水性强、难在 C18 上保留的化合物 |
| 氨基（NH2） | 正相/HILIC | 糖类、核苷 |
| 混合模式（C18 + IEX） | 疏水 + 离子 | 两性化合物、同时分析酸碱性杂质 |
UHPLC 迁移：C18 颗粒 < 2 μm（如 BEH、HSS 系列）可将常规 HPLC（5 μm）方法速度提高 3–5 倍，同时保持或提升分辨率；需要高压泵（400–1000 bar）。
预期结果： 确定色谱模式和固定相，理由明确，与分析物极性和分子量相符。
失败处理： 若不确定，先试用 C18（反相）作为起点；若目标物保留过弱（k < 1），改用苯基柱或调整 pH；若保留过强，加大有机溶剂比例或换用 C8。
流动相组成是反相 HPLC 方法开发的核心：
常用流动相组成（反相 HPLC）：
| 水相（A 相） | 有机相（B 相） | 适用范围 |
|---|---|---|
| 0.1% 甲酸水溶液 | 乙腈（ACN） | 通用，LC-MS 兼容 |
| 10 mM NH4OAc（pH 4.0） | ACN 或 MeOH | 碱性化合物 |
| 10 mM 磷酸二氢钾（pH 2.5） | ACN | 酸性化合物，UV 检测 |
| 5 mM NH4HCO3（pH 9.0） | ACN | 碱性化合物，LC-MS 兼容 |
梯度程序设计原则：
梯度速率 = ΔB%/ 梯度时间。慢梯度（1–2%/min）提高分辨率；快梯度（5–10%/min）缩短分析时间。pH 对保留的影响（反相 HPLC）：
预期结果： 确定流动相 pH、有机溶剂种类、梯度范围和速率，使关键峰对的分辨率 Rs ≥ 1.5。
失败处理： 若关键峰对共洗脱，调整 pH（±1 单位）或更换有机溶剂（ACN 换 MeOH，选择性不同）；若保留时间过短（< 2 min），降低起始有机相比例；若分析时间过长，提高梯度速率。
流速和柱温影响分析速度、柱效和背压：
流速：
柱温：
## 流速和柱温优化结果
| 条件 | 流速（mL/min） | 柱温（°C） | 背压（bar） | Rs（关键峰对） | 运行时间（min） |
|-----|------------|---------|----------|------------|------------|
| 初始 | [值] | [值] | [值] | [值] | [值] |
| 优化后 | [值] | [值] | [值] | [值] | [值] |
预期结果： 流速和柱温的优化使分析时间缩短，同时保持 Rs ≥ 1.5，背压在系统规格范围内。
失败处理： 若背压超出系统上限（如泵的最大压力为 400 bar），降低流速或换用颗粒更大的色谱柱（3 μm → 5 μm）；若 Rs 随温度升高而下降，保持较低柱温。
根据分析物的结构特征选择最合适的检测器：
| 检测器 | 检测原理 | 适用化合物 | LOD（典型值） |
|---|---|---|---|
| UV/DAD（可变波长/二极管阵列） | 紫外吸收 | 含发色团的化合物（最通用） | ~ 1–10 ng（注射量） |
| 荧光（FLD） | 激发-发射 | 天然或衍生化荧光物质 | ~ 1–100 pg |
| 蒸发光散射（ELSD） | 光散射 | 无 UV 发色团的化合物 | ~ 10–100 ng |
| MS（单四极杆/三重四极杆） | 质荷比 | 通用，高选择性，结构鉴定 | ~ 0.1–10 pg（SRM 模式） |
| 电化学（ECD） | 氧化还原 | 酚类、儿茶酚胺、核苷 | ~ 10–100 fg |
| 电导率（CD） | 离子电导率 | 无机离子、有机酸、碱 | ~ 1–10 ng（IEC 联用） |
UV 检测波长优化：
预期结果： 检测器类型和检测参数已确定，目标 LOD/LOQ 可以达到。
失败处理： 若 UV 灵敏度不足，考虑荧光衍生化（柱前或柱后）或切换至 MS 检测；若 MS 灵敏度不足（复杂基质抑制），优化样品前处理（固相萃取、蛋白沉淀）。
方法投入使用前进行系统适应性检验：
| 参数 | 验收标准 | 测量方法 |
|---|---|---|
| 理论板数（N） | ≥ 2000（对于 15 cm 柱） | N = 5.54(tR/w½)² |
| 分辨率（Rs，关键峰对） | ≥ 2.0 | Rs = 2(tR2 - tR1)/(w1 + w2) |
| 拖尾因子（Tf） | 0.8–2.0（理想为 1.0） | Tf = W0.05/(2f) |
| 保留时间 %RSD（n=6） | < 0.5% | 6 针连续进样 |
| 峰面积 %RSD（n=6） | < 2.0% | 6 针连续进样 |
| 梯度重现性 | 保留时间差 < 0.2 min | 6 针连续进样 |
预期结果： 所有系统适应性参数满足验收标准，方法可进入正式验证（按 ICH Q2(R2)）。
失败处理： 若 Rs 不足，参考第 2 步调整梯度；若 Tf > 2.0（严重拖尾），优化流动相 pH（调整 ±0.5 单位）或添加离子对试剂（碱性化合物可加 TFA 或乙酸）；若重现性差，检查自动进样器进样量精度和流动相脱气状态。
develop-gc-method — 挥发性化合物的 GC 方法开发validate-analytical-method — HPLC 方法的 ICH Q2(R2) 完整验证interpret-chromatogram — 解读 HPLC 谱图中的峰参数troubleshoot-separation — 处理保留时间漂移、峰形问题等故障